Арабиноксилановые рисовые отруби (Биобран) подавляют уровень виремии у пациентов с хронической инфекцией HCV: рандомизированное исследование

Международный журнал иммунопатологии и фармакологии 1-7 © The Author (s) 2016 Перепечатки и разрешения: sagepub.co.uk/journalsPermissions.nav DOI: 10.1177 / 0394632016674954 iji.sagepub.com

Аннотация 

Современные методы лечения вирусного гепатита С (HCV, ВГС) имеют серьезные побочные эффекты и очень дороги. Необходимо изучить эффективные методы анти-ВГС лечения натуральными средствами, которые менее токсичны и более экономичны. В настоящем исследовании 37 пациентов с хроническим HCV были рандомизированы на две группы и пролечены либо пегилированным интерфероном (PEG IFN) в сочетании с рибавирином (n = 21), либо Биобраном (арабиноксиланом из рисовых отрубей, 1 г / день) (n = 16). Мы исследовали виремию, ферменты печени, уровни интерферона-γ (IFN-γ) в сыворотке крови до и через три месяца после лечения, а также токсические эффекты. Обе группы пациентов продемонстрировали значительное и сопоставимое снижение вирусной нагрузки после трехмесячного курса лечения по сравнению с исходной вирусной нагрузкой (P˂0,05). Кроме того, лечение Биобраном привело к значительному увеличению уровня IFN-γ (P˂ 0,001). У пациентов в группе «ПЭГ IFN + рибавирин» отмечалась лихорадка, анемия, тромбоцитопения и легкая усталость. У пациентов в группе «Биобран» не было выявлено побочных эффектов и они сообщали о хорошем самочувствии. Мы пришли к выводу, что терапия Биобраном –  потенциальная новая схема, которая оказывает действие, аналогичное терапии по схеме «PEG IFN +рибавирин», и является безопасной и экономически эффективной при лечении хронического HCV. Обнаруженная нами эффективность Биобрана против инфекции HCV стала основанием для дальнейшего исследования в рамках множественных клинических испытаний (регистрация клинических испытаний: NCT02690103).

Ключевые слова арабиноксилан, биобран, вирус гепатита С (HCV), пегилированный интерферон (PEG IFN), виремия. Дата приема: 15 апреля 2016 года; принято: 27 сентября 2016 г.

Введение

Вирусом гепатита С (HCV) заражено около 130-150 миллионов человек во всем мире (около 2-3% населения). Примерно 700 000 смертей в год связано с последствиями инфекции и ее наличие является основной причиной опасных для жизни заболеваний печени, таких как цирроз и гепатоцеллюлярная карцинома. Существует большая вариабельность распространенности ВГС в мире: от 1% населения страны до более 10%. Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) заявляют, что распространенность HCV самая высокая в Египте: здесь инфицировано около 10% населения. Исследования также показывают, что у HCV имеется несколько генотипов. Генотип 1 наиболее распространен в США и Японии, а генотип 4 наиболее распространен в Египте. Хронический HCV развивается у 60-85% пациентов с острым ВГС. Цирроз возникает у 15-30% пациентов с хронической формой заболевания, а гепатоцеллюлярная карцинома встречается у 1-3%, причем оба эти заболевания связаны со смертностью больных. Вакцина для защиты от заражения ВГС до настоящего времени не разработана. Текущие методы лечения включают терапию пегилированным интерфероном (ПЭГ ИФН), рибавирином, боцепревиром, телапревиром и Софосбувиром (совалди). PEG IFN активирует клеточные антивирусные реакции, однако примерно у 50% респондентов будут рецидивы после отмены лечения. Механизм действия Рибавирина неизвестен, но он может быть ответственным за прямое ингибирование РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp) или изменение нуклеотидного пула, необходимого для репликации. Несколько исследований показали, что комбинация ПЭГ ИФН и рибавирина более эффективна, чем монолечение. Боцепревир и телапревир являются новыми ингибиторами протеазы и действуют на вирусную протеазу NS3-4a, они особенно эффективны для лечения генотипа 1, и используются либо отдельно, либо в сочетании с интерфероном. Наконец, Софосбувир представляет собой нуклеотидный аналог, который используется с другими лекарственными средствами, такими как рибавирин, для лечения больных с генотипами 2 и 3 и с PEG IFN для генотипов 1 и 4. Софосбувир ингибирует РНК-полимеразу (ингибитор NS5B), которую вирус гепатита использует для репликации своего РНК. Вышеупомянутые синтетические противовирусные препараты для лечения HCV имеют много побочных эффектов, а некоторые из этих препаратов, таких как Софосбувир, очень дорого стоят. Поэтому необходимо изучить терапевтическое применение натуральных продуктов, которые нетоксичны, доступны по цене и оказывают анти-ВГС-эффект. Биобран представляет собой модифицированный экстракт рисовых отрубей, который содержит полисахарид – β1, 4-ксилопиронозную гемицеллюлозу. Основная химическая структура Биобрана представляет собой арабиноксилан с ксилозой в основной цепи и арабинозным полимером в боковой цепи. Биобран является мощным модификатором биологического ответа (BRM), который, как известно, повышает активность NK-клеток, активирует дендритные клетки (DCs), модулирует продукцию интерферона и усиливает внутриклеточное уничтожение микробов фагоцитарными клетками человека. Предыдущие исследования показали, что Биобран является защитой от появления различных типов злокачественных новообразований, включая связанное с окислительным стрессом развитие карциномы Эрлиха, с γ -излучением и активностью ВИЧ2. В текущем исследовании мы изучали анти-HCV-эффект MGN-3 / Биобран. Мы представляем результаты предварительного исследования способности Биобрана снижать виремию у пациентов с хроническим HCV. Кроме того, мы исследовали влияние Биобрана на ферменты печени и воспаление, и оценили его побочные эффекты.

Предметы и методы

Биобран

Биобран представляет собой денатурированную гемицеллюлозу, которая получается путем взаимодействия гемицеллюлозы рисовых отрубей с несколькими гидролизующими углеводы ферментами, полученными из грибов Шиитаке. Это полисахарид, который содержит β-1, 3-глюканы и активированную гемицеллюлозу. Биобран любезно предоставила компания Daiwa Pharmaceuticals Co. Ltd., Токио, Япония.

Критерии включения / исключения пациентов

Критерии включения:

1. Возрастной диапазон 18-65 лет, пол любой.

2. Доказательства развития хронического активного гепатита после инфицирования HCV, подтвержденного биопсией тканей печени.

3. Готовность принять участие в исследовании и дать письменное согласие.

Критерии исключения:

1. Пациенты с F0 и F4 по гистопатологии печени.

2. Наличие аутоиммунного гепатита.

3. Беременные и кормящие женщины.

4. Имеющиеся признаки портальной гипертензии и панцитопении.

5. Наличие серьезной психотравмы.

6. Наличие других инфекций, таких как HBV и ВИЧ.

7. Пациенты, получающие другое противовирусное лечение.

8. Неспособность дать письменное согласие.

План клинического исследования

Для рандомизированного исследования мы отобрали 37 пациентов, которые были госпитализированы в больницу «Каср эль эйн» в Каире, Египет. У пациентов был диагностирован HCV, генотип 4. Исследование было одобрено Каирской университетской больницей (Каир, Египет) и Институциональным наблюдательным советом (IRB) в Университете медицины и науки Charles R Drew (CDU) (Лос-Анджелес, Калифорния, США). Протокол исследования соответствовал этическим принципам Хельсинкской декларации 1975 года, как это было отражено в предварительном одобрении Каирским университетом, больницей Аль-Каср Эль-Эйн в Каире (Египет) и IRB в Каирском университете (Египет) и ХДС (Лос-Анджелес, Калифорния, США).

Таблица 1. Клинические показатели пациентов с HCV, получавших ПЭГ IFN + рибавирин (контроль) и Биобран. 

* Статистически значимые (P <0,05).

Пациенты

В текущем исследовании приняли участие 37 пациентов (23 мужчины, 14 женщин, возраст 15-69 лет) с ВГС (генотип 4). Информированное согласие было получено ото всех субъектов. Пациенты были случайным образом распределены по двум группам: группа Biobran (экспериментальная) (n = 16) и группа PEG IFN +рибавирин (контрольная) (n = 21). До лечения клинические характеристики были определены для пациентов в каждой группе (таблица 1). Клинические характеристики пациентов с HCV определялись по исследованиям уровня вируса гепатита C, альфа-фетопротеина (AFP), общего количества лейкоцитов (ТЛК), количества тромбоцитов (PLT), уровня гемоглобина (Hb), уровня холестерина, уровня триглицеридов (TG), уровня гликированного гемоглобина (HbA1c), уровня креатинина, уровня альбумина, уровня билирубина, свертывания крови с использованием международного нормированного соотношения (INR) и уровня случайного сахара в крови (RBG).

Протокол определения субпопуляций лимфоцитов

Свежую периферическую кровь собирали в пробирки с ЭДТА, анализ общего количества лейкоцитов (WBC) выполнялся с использованием Celltac α - 6400 series-Nihon Khoden. Дифференциальный подсчет WBC был сделан на мазках крови, окрашенных по Лейшману. Образец цельной крови инкубировали с анти-человеческими CD16-FITC и античеловеческими реагентами моноклональных антител CD56-PE при 4 ° C. Ядросодержащие клетки отделяли от красных кровяных клеток и определяли выход клеток с помощью автоматизированного счетчика. Образцы тестировали с использованием проточного цитометра Beckman Coulter EPICS XL для определения субпопуляций лимфоцитов: клеток CD16 + CD56-, CD16-CD56 + и CD16 + CD56 +.

Процедуры

Пациенты контрольной группы (возраст 40 ± 11 лет, 14 мужчин и 7 женщин) получали подкожно в течение трех месяцев 180 мкг PEG IFN (производитель Пегасис-Рош). Кроме того, им давали рибавирин в соответствии с их массой тела (1200 мг для веса более 75 кг и 1000 мг для тех, кто не достиг веса 75 кг). Группа «Biobran» (возраст 45 ± 12 лет, 9 мужчин и 7 женщин) получало лечение Биобраном в дозе 1 г в день ( расфасованным в пакетики),  который принимался внутрь во время еды на протяжении трех месяцев. Уровни вирусной нагрузки, проявления интоксикации, уровни ферментов печени, уровни интерферона-γ (IFN-γ) и процент субпопуляций лимфоцитов были исследованы до лечения и через три месяца после лечения. Вирусную нагрузку анализировали с помощью теста количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием анализатора COBAS® TaqMan® (Roche Corporation). Уровни IFN-γ, AFP, ALT и AST анализировали с использованием специфических наборов Elisa производства Spectrum Chemical Manufacturing Corporation, Гардена, Калифорния, США. Токсические эффекты оценивались с помощью опросника, наблюдений врача и результатов лабораторных исследований. Субпопуляции лимфоцитов и IFN-γ были исследованы только в группе «Biobran» в начале исследования и через три месяца после лечения. 

Таблица 2. Уровень вирусной нагрузки и ферментов печени в начале исследования и через три месяца в обеих группах.

Статистический анализ

Описательная статистика использовалась для характеристики исследуемой популяции. Категориальные переменные представлялись как число и процент. Непрерывные переменные представлялись как среднее и стандартное отклонение. Чтобы проверить статистические различия между группой «Biobran» (экспериментальной) и контрольной группой, мы использовали критерий хи-квадрат для категориальных переменных, t-тест для нормально распределенных непрерывных переменных и U-критерий Манна-Уитни для нерегулярно распределенных непрерывных переменных. Парный t-тест использовался для проверки статистической разницы между исходным уровнем и значениями в течение трех месяцев после лечения в каждой группе для нормально распределенных непрерывных переменных. Для ненормально распределенных переменных мы использовали непараметрический медианный критерий Вилконсона. Чтобы проверить статистическую разницу в исходной вирусной нагрузке, трехмесячную вирусную нагрузку после лечения и снижение вирусной нагрузки через три месяца после лечения между группой «Biobran» (экспериментальной) и контрольной группой, мы использовали непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Данные анализировались с использованием SPSS версии 22 и STATA версии 14, а значения P ≤ 0,05 считались статистически значимыми.

Результаты

Клинические характеристики пациентов с ВГС

В таблице 1 представлен диапазон измеренных характеристик для пациентов в контрольной группе и группе «Biobran». Группа «Biobran» имела статистические отличия от группы контроля (PEG IFN плюс рибавирин) в исходных уровнях трех из 14 переменных: TG, HbA1c и креатинина (P≤0,05). Не было статистически значимой разницы между двумя группами (P˂0,05) во всех других исходных переменных.

Уровень виремии

Основным результатом был уровень виремии у пациентов после лечения. Эффект лечения Биобраном и PEG IFN + рибавирин на уровень вируса проиллюстрирован в таблице 2. Уровни ПЦР до и через три месяца после лечения показали, что пациенты, которые получали Биобран, продемонстрировали значительное снижение вирусной нагрузки по сравнению с исходным значением (средний уровень вирусной нагрузки: медиана до = 224,500 и медиана через три месяца = 70 150, средняя разница = -35,200, P = 0,023). Пациенты, получавшие ПЭГ ИФН + рибавирин, продемонстрировали значительное снижение вирусной нагрузки по сравнению с исходным значением (средний уровень вирусной нагрузки: медиана до = 300 000, медиана в три месяца = 16, средняя разница = -153,984, P = 0,001). Из 21 пациента в группе ПЭГ IFN + рибавирин 11 пациентов (52,4%) имели вирусные нагрузки, которые были очень низкими и неопределенными (то есть уровень вирусной нагрузки составлял 16). Пациенты в обеих группах показали значительное снижение вирусной нагрузки по сравнению с исходным значением (P≤0,05). Статистической разницы между медианной вирусной нагрузкой двух групп в базовой линии нет (P = 0,175). Статистическая разница между медианной вирусной нагрузкой двух групп в ПЦР после трехмесячного периода лечения (Р = 0,377) и медианным снижением вирусной нагрузки по сравнению с исходным уровнем (Р = 0,235) отсутствует.

Ферменты печени

Исследования ферментов печени (ALT и AST) показаны в таблице 2. Лечение Биобраном через три месяца показало увеличение на 21,3% уровня ALT и на 11,0% уровня AST по сравнению с исходными значениями, но они не были статистически значимыми (P˂ 0,05). Напротив, пациенты, получавшие ПЭГ ИФН + рибавирин, показали снижение уровня обоих ферментов через три месяца после лечения, и это было статистически значимо только для АЛТ (Р = 0,007).

Уровни интерферона-γ

Уровни IFN-γ были исследованы на начальном этапе и через три месяца у пациентов группы «Biobran». Результаты на рисунке 1 показывают распределение динамики уровней IFN-γ среди 16 пациентов следующим образом: у 9 из16 пациентов (56,3%) отмечено увеличение в 2-4,2 раза, у 5 из 16 пациентов (31,3%) отмечено небольшое увеличение и у 2  из 16 пациентов (12,5%) увеличения не отмечено. В целом, среднее исходное значение IFN-γ составляло 16,1 ± 1,7 пг / мл, а через три месяца оно составляло 34,4 ± 19,8 пг / мл, что представляет собой двукратное увеличение через три месяца по сравнению с исходным значением (P˂ 0,001).

Рисунок 1. Уровни IFN-γ среди пациентов из группы «Biobran» до и через три месяца после лечения (n = 16).

Таблица 3. Субпопуляции лимфоцитов на начальном этапе и три месяца в группе «Biobran».

Субпопуляции лимфоцитов

Субпопуляции лимфоцитов были исследованы на исходном этапе и три месяца у пациентов группы «Biobran». Результаты, приведенные в таблице 3, показали, что в клетках CDMA + CD56-, CD16-CD56 + и CD16 + CD56 + не наблюдается значительных изменений в течение трех месяцев по сравнению с исходным значением (P˂0,05).

Токсичность

Токсичность Биобрана и PEG IFN +рибавирин оценивали по анкете, наблюдению врача и результатам лабораторных анализов. У пациентов, получавших ПЭГ ИФН + рибавирин, отмечалась легкая усталость, лихорадка, расстройства пищеварения, потеря веса, сухой кашель, гепатомегалия, анемия, тромбоцитопения, головная боль и боль в теле. Напротив, у пациентов, получавших Биобран, не были выявлены побочные эффекты, и они не сообщали о проблемах со здоровьем. В таблице 4 приведены более подробные сведения о симптомах, которые отмечались у пациентов в обеих группах.

Стоимость

Стоимость анти-HCV лечения значительно варьируется. Трехмесячный запас Биобрана может стоить менее 1000 долларов США, а другие препараты анти-HCV могут быть намного дороже. Например, 12-недельный запас ПЭГ IFN + рибавирин может обойтись пациентам в Египте в 3000 долларов США, а американским пациентам – до 10 000 долларов. Стоимость Софосбувира еще более высока - 84 000 долларов США за трехмесячный запас.

Обсуждение

Настоящее исследование о анти-HCV активности Биобрана было мотивировано предыдущими исследованиями, которые показали его антивирусную активность. Например, было показано, что Биобран проявляет активность против ВИЧ, ингибируя репликацию ВИЧ-1, как показано в мононуклеарных клетках периферической крови (РВМС) у здоровых людей, инфицированных штаммом SF ВИЧ-1. Биобран ингибирует образование синцитиев как у больных СПИДом, так и у PBMC-инфицированных здоровых субъектов. Кроме того, было выявлено, что Биобран предотвращает симптомы простуды у пожилых людей со значительным снижением проявлений синдрома общего переохлаждения (CCS) – кашля, недомогания, лихорадки, боли в горле и выделений из носа / чихания. Общий балл CCS для пожилых пациентов, принимавших Биобран, был примерно в три раза ниже, чем общий балл без приема Биобрана. Эти результаты побудили нас продолжить исследования потенциальной возможности Биобрана ограничивать виремию у пациентов с хроническим HCV. Результаты этой статьи показали, что у пациентов, получавших Биобран, наблюдалось значительное снижение вирусной нагрузки после трехмесячного курса лечения по сравнению с исходной вирусной нагрузкой. Снижение вирусной нагрузки у пациентов в группе Биобран было сопоставимым с тем, которое наблюдалось в контрольной группе, где пациенты получали стандартное лечение ПЭГ IFN + рибавирин (P≤ 0,05). Кроме того, у пациентов, получавших ПЭГ ИФН + рибавирин, было отмечено снижение уровня обоих ферментов печени после лечения, в соответствии с ранее проведенным исследованием Hui с соавт., который обнаружил снижение уровня АЛТ через три месяца после лечения ПЭГ IFN + рибавирин. Это уменьшение, по-видимому, продолжается и в течение более длительных периодов, как это показано у Levent с соавт. С другой стороны, у тех пациентов, которые лечились Биобраном, было отмечено незначительное изменение уровня этих двух ферментов. Точные механизмы, с помощью которых Биобран оказывает ингибирующее действие на HCV, еще предстоит изучить. HCV поступает в клетки путем связывания с рецепторами-поглотителями типа b1; его экспрессия подавляется липополисахаридами. Поскольку Биобран является полисахаридом и может функционировать как другие экстрагированные из грибов и бактерий полисахариды,  то возможно, что он ингибирует репликацию HCV путем подавления рецепторов HCV. В качестве альтернативы можно предположить, что Биобран способен действовать как терапевтическая вакцина путем усиления иммунных анти-HCV реакций защитными клетками хозяина, и, таким образом, помогает снизить вирусную нагрузку. Это мнение частично подтверждается данным исследованием, показавшим, что у большинства пациентов, получавших Биобран, отмечается повышенный уровень IFN-γ. Исследования показали, что IFN-γ является мощным ингибитором репликации вируса. Кроме того, мы и другие исследователи ранее выявили, что Биобран модулирует различные иммунные клетки, такие как CD4 + и CD8 + T-клетки8-10 и NK-клетки, 3-6 как in vitro, так и in vivo. Известно, что эти иммунные клетки играют важную роль в борьбе с вирусной инфекцией, включая HCV. Интересно отметить, что в группе «Biobran» не отмечались побочные эффекты и пациенты сообщали о хорошем самочувствии, в то время как среди пациентов группы  «PEG IFN + рибавирин» наблюдалась лихорадка, анемия и тромбоцитопения, и они сообщили о легкой усталости. Кроме того, в то время как стоимость стандартной терапии (PEG IFN + рибавирин) для лечения хронического генотипа HCV 4 в Египте составляет $3000 долларов за трехмесячный курс и может достигать $10 000 долларов в США, стоимость трехмесячного курса лечения Биобраном составляет менее $1000 долларов США. С учетом вышесказанного, можно сделать заключение, что Биобран является потенциальным новым терапевтическим средством для лечения хронического HCV – недорогим, безопасным и эффективным. Дальнейшие исследования необходимы для определения его эффективности у большого числа инфицированных HCV пациентов в течение более длительных периодов времени.

Таблица 4. Клинические данные пациентов с HCV, получавших ПЭГ IFN + рибавирин или Биобран. 

* Потеря веса определялась любым уровнем потери веса после введения в исследование.

Благодарность

Мы хотели бы поблагодарить нашего коллегу и сотрудника д-ра S Gollapudi, UC Irvine за его критическое осмысление и руководство этим исследованием, а также докторантов Бенджамина Виньюма и Кэи Розеру за помощь в подготовке иллюстраций и результатов клинических исследований.

Декларация конфликта интересов

Автор (ы) не заявляли о потенциальных конфликтах интересов в отношении исследований, авторства и / или публикации этой статьи.

Финансирование

Финансирование исследования и препарат Биобран были предоставлены Daiwa Pharmaceutical Co., Ltd., Токио, Япония. Это исследование частично поддерживалось грантом NIH-NIMHD. U54 MD007598 и NIH-NCATS. UL1 TR000124.