Арабиноксилан минимизирует главный и острый побочный эффект цисплатина – потерю веса

Аннотация

Алкилирующие вещества и антиметаболиты остаются главными составляющими большого числа различных типов химиотерапии рака на основании их избирательного действия на митотический цикл опухолевых клеток, который происходит быстрее, чем в обычных клетках. Среди новых противораковых препаратов с содержанием платины, главный - цисплатин (Цис-платина II диамин дихлорид) известен своими положительными противораковыми свойствами в отношении взаимодействия цисплатина и нитей ДНК. Цисплатин (Розенберг и др., 1969) был одобрен для использования в лечение опухолей головы и шеи, рака мочевого пузыря и шейки матки (Лерер и Айнхорн, 1984), а также при лечении рака молочных желез (Смит и Талбот, 1992). Хотя рак легких, желудка, молочных желез, колоректальный рак и рак простаты являются основными самыми часто встречающимися видами рака в цивилизованных странах, многие из этих видов злокачественных новообразований не поддаются лечению химиотерапией. Лекарственные схемы с платиной в своем составе могли бы быть выбором лечения в данных ситуациях, но они очень часто вызывают значительные побочные эффекты такие, как тошнота, рвота, нефропатия и гипомагнийемия из-за повреждений почечных канальцев. Более того, в добавление к потере слуха и периферической нейропатии, миелосупрессия является одним из самых серьезных подавляющих побочных действий. Следовательно, любое снижение побочных эффектов цисплатина будет очень ценным. Таким образом, мы изучали влияние модифицированных рисовых отрубей (BioBran) на профилактику потери веса у мышей при допустимо максимальных дозах цисплатина. Другие исследователи уже кратко комментировали действия ферментированных рисовых отрубей против стресса и против усталости (Ким и др., 2001) или указывали на положительное влияние BioBran на некоторые обратные действия противораковых препаратов у крыс (Якоби и др., 2000).

Протокол эксперимента был одобрен Советом по этике исследований над животными в университете МакМастер в Онтарио, Канада. Самки белых мышей (4 недели) были закуплены в компании Charles River Canada. Период акклиматизации составил одну неделю. Мыши были взвешены и разделены на 7 групп по 5 мышей в каждой на основании минимальной разницы в весе в каждой группе. Средний вес всех мышей, над которыми велся эксперимент (17.43 г при стандартном отклонении ±0.51 г) в начале настоящего эксперимента был определен, как 100% от массы тела. Пять мышей были помещены в отдельные клетки, как группа с нормальным обменом веществ, в хорошо проветриваемой удобной комнате. Мышам был обеспечен свободный доступ к корму и питью. Циклы смены дневного света и темноты составили 12 часов.

Цисплатин и диметилсульфоксид (ДМСО) были приобретены у компании Sigma Aldrich (Оаквиль, Онтарио, Канада). Так как цисплатин хуже растворяется в воде или забуференном фосфатом физиологическом растворе (ЗФР), ДМСО использовался в качестве растворителя для цисплатина (0.1% в объемном соотношении).

В данном эксперименте использовались следующие характеристики BioBran. Обезжиренный экстракт рисовых отрубей был модифицирован путем ферментации гликозидазами, такими как амилаз, галактозидаза и глюкуронидаза, полученными из мицелия грибов шиитаке (lentis edodes). Конечный продукт модифицированных рисовых отрубей был хорошо растворим в воде. Конечный продукт состоял из полисахаридов, в основном была представлена гемицеллюлоза арабиноксилана и протеин (13.2%), определяемые методом Фолина-Чикальтеу (1951). Продукт был произведен компанией Daiwa Pharmaceuticals, Токио, Япония и продавался под торговым названием MGN-3 (BioBran) в Северной Америке. Продукт был любезно предоставлен на безвозмездной основе доктором Хироаки Маеда из компании Daiwa Pharmaceuticals (патент США 5560914).

За одну неделю до введения цисплатина, двум группам мышей вводился BioBran ежедневно путем зондового питания в объеме 0.1 мл при концентрации 10 мг\мл BioBran (сухой вес), растворенных в воде или путем внутрибрюшной инъекции в объеме 0.1 мл при той же концентрации BioBran, растворенных в забуференном фосфатом физиологическом растворе. Доза 1 мг BioBran рассчитывалась на основе рекомендуемой для человека дозы (50 мг\кг). Одна инъекция цисплатина вводилась в объеме 0.1 мл при концентрации 15 мг\кг цисплатина в забуференном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 0.5% ДМСО интраперитонеально. Две группы мышей получали воду через зонд или внутрибрюшное введение забуференного фосфатом физиологического раствора, а неделю спустя обеим группам мышей вводился цисплатин. Мыши, получавшие питьевую воду перорально и мыши, получавшие забуференный фосфатом физиологический раствор с или без ДМСО в качестве растворителя для цисплатина, рассматривались как три отдельные контрольные группы. Вес тела каждой мыши отслеживался ежедневно. По сравнению со средним весом всех мышей в начале эксперимента при произвольном проценте 100%, был определен вес тела каждой мыши.

На следующий день после инъекций цисплатина была выявлена потеря веса у мышей в обеих группах с и без введения BioBran. На 5-й день лечения цисплатином наблюдалась еще большая потеря веса у мышей в обеих группах с и без введения BioBran перорально и интраперитонеально. Большая потеря веса наблюдалась у мышей, которым вводили цисплатин без дополнительного введения BioBran. Хотя потеря веса была близка к 20% от стандартного веса тела мышей в группе, где лечение проводилось цисплатином, не было отмечено летального исхода ни одной мыши, а также не выявлено таких побочных эффектов цисплатина, как диарея или кровотечение из прямой кишки. Как показано на рисунках 1 и 2, набор веса тела у мышей начался на 14 день после инъекций цисплатина в обеих группах, а темп восстановления веса у группы мышей, которым вводился BioBran и перорально, и интраперитонеально был быстрее, чем у мышей в контрольной группе.

Интенсивность потери веса у мышей от введения цисплатина зависела от дозы (данные не представлены). Было обнаружено, что пероральное и интраперитонеальное введение BioBran ускорило защиту против резкой потери веса у мышей, вызванной введением цисплатина. На Рисунке 1 показана статистически значимая разница между кривой потери веса, вызванной приемом цисплатина в группе мышей, которым перорально вводился BioBran и мышами, которым давалась питьевая вода. Такие данные были получены в результате дисперсионного анализа (Р<0.05) в фазах II, III и IV. На рисунке 2 показана статистически значимая разница между кривой потери веса, вызванной приемом цисплатина в группе мышей, где интраперитонеально вводился BioBran и в группе, где вводился забуференный фосфатом физиологический раствор. Такие данные были получены в результате дисперсионного анализа в фазах II, III и IV. При проведении дисперсионного анализа для сравнения защитного действия BioBran на потерю веса при пероральном и интраперитонеальном введении отрубей, не было отмечено значительной разницы. Полученные результаты показывают, что полезные вещества в составе модифицированных рисовых отрубей (BioBran), обладающие защитным действие против потери веса из-за введения цисплатина, были одинаково эффективны и при пероральном и интраперитонеальном введении.

 Для того чтобы определить поглощенные соединения с BioBran у мышей, получавших лечение данным препаратом, мы использовали поликлональные антитела к BioBran у белых мышей. 0.1 мл раствора BioBran (1мг\мл), эмульгированных с таким же объемом полного адъюванта Фрейнда вводился интраперитонеально. За этим последовало усиление иммунизации 0.1 мл раствора BioBran (1 мг\мл), эмульгированных с таким же объемом неполного адъюванта Фрейнда. Так как модифицированные рисовые отруби могут состоять из полисахаридов, необходимо выявить иммунореактивные вещества этих соединений в слизистой мышей, которых лечили BioBran.

 Рисунок 1. Сравнение профиля сокращенного процента веса тела мышей, которым давали цисплатин (15 мг\кг) интраперитонеально на восьмой день с (незакрашенные квадраты) или без перорального приема BioBran (1 мг в день) с первого дня (закрашенные квадраты). Сто процентов веса мышей на оси ординат означает средний все мыши в начале эксперимента (17.43 г ± 0.51 г). Контрольная группа означает, что не применялось лечение ни цисплатином, ни модифицированными рисовыми отрубями. Ось абсцисс показывает дни эксперимента с начала введения BioBran. Сокращенный процент веса тела у мышей показывает статистически значимую разницу между группами с или без перорального приема BioBran в момент максимального снижения веса тела и в последнюю фазу восстановления. Черточки означают стандартное среднее отклонение у пяти мышей в каждой группе. Р<0.01, *Р<0.05

 Рисунок 2. Сравнение профиля сокращенного процента веса тела мышей, которым давали цисплатин (15мг\кг) интраперитонеально на восьмой день с (незакрашенные квадраты) или без перорального приема BioBran (1 мг в день) с первого дня (закрашенные квадраты). Сто процентов веса мышей на оси ординат означает средний все мыши в начале эксперимента (17.43г±0.51г). Контрольная группа означает, что не применялось лечение ни цисплатином, ни BioBran. Сокращенный процент веса тела у мышей показывает статистически значимую разницу между группами с или без перорального приема BioBran в момент максимального снижения веса тела и в последнюю фазу восстановления. Черточки означают стандартное среднее отклонение у пяти мышей в каждой группе. Р<0.01, *Р<0.05

С этой целью мы приобрели планшеты Covalink для проведения количественного анализа полипептидов, а также полисахаридов. Были также приобретены планшеты PolySorb для проведения количественного анализа полипептидов у компании NUNC (Миссисауга, Онтарио, Канада) для определения иммуносорбентов, связанных с ферментами (ELISA) в соответствии с методом, предложенным Зиленом и другими (Zielen et al., 1996). Чтобы убедиться в валидности анализа ELISA, на рисунке 3 показана значимая разница в титрах поликлональных антител мышей против модифицированных рисовых отрубей с (+) или без (-) ферментации BioBran протеиназом К для полипептидов. Конъюгированное с пероксидазой антитело кролика к IgG антителам мыши в качестве второго антитела для оптической плотности при длине волны 492 мм считывателя ELISA, было приобретено в компании Медицинские Биологические Лаборатории (Medical Biological Laboratories), Нагойя, Япония. Полученные данные позволяют выделить полипептид, а также соединения полисахаридов из BioBran на микротитрационном планшете Covalink.

Рисунок 3. Поликлональные антитела к BioBran были протестированы при помощи анализа ELISA с использованием микротитрационного планшета Covalink. BioBran были ферментированы протеиназом К для устранения антигенов протеина. Гистограмма слева (-) показывает титр поликлональных антител к BioBran в целом без ферментации протеиназом К и указывает, что антигены и протеина и полисахарида присутствуют в BioBran. Гистограмма посередине (+) показывает титр поликлональных антител к BioBran после ферментации протеиназом К и указывает, что только антигены полисахарида присутствуют в BioBran.

Иммунореактивные соединения поглощенные BioBran в сыворотке мышей, получавших пероральное введение препарата, можно выявить при помощи процедуры абсорбции иммунологического метода при использовании этих поликлональных антител к BioBran. Таким образом, иммунореактивные вещества BioBran в сыворотке мышей должны абсорбироваться поликлональными антителами к BioBran после инкубации при температуре 37 °C в течение 60 минут и центрифугировании (15 000 оборотов в минуту) в течение 30 минут при температуре 4 °C. Серийные образцы сыворотки были взяты у трех мышей до перорального введения BioBran (10 мг\кг) и от 1 до 3 часов после перорального введения BioBran. Иммунореактивные вещества BioBran в сыворотке мышей были обработаны в двух разных растворах (100Х и 1000Х) до и после абсорбции поликлональными антителами, а BioBran измерялись методом ELISA на предмет стабильности процедуры абсорбции для микротитрационного планшета Covalink. На Рисунке 4 показан значимый спад титров поликлональных антител к BioBran после абсорбции в период 2 или 3 часа после их перорального приема. Этот спад титров поликлональных антител к BioBran был статистически значимым (критерий Уилкоксона Р<0.01) и указывал, что иммунореактивные вещества BioBran должны присутствовать в сыворотке мышей, которым перорально вводился препарат. Являются ли эти вещества активными компонентами, отвечающими за защитное действие против потери веса из-за приема цисплатина только еще предстоит определить. Тем не менее, настоящие результаты ясно показывают, что пероральный прием BioBran оказался эффективным в борьбе с таким побочным эффектом при лечении мышей цисплатином, как потеря веса. Поликлональные антитела к BioBran, разработанные в настоящем исследовании, могли определить потенциал BioBran, тесно связанный с защитной функцией против побочных последствий приема противораковых препаратов.

Сообщалось, что обезжиренная гемицеллюлоза рисовых отрубей повышает число лимфоцитов периферической крови у крыс, а соотношение Т-хелперов к Т-супрессорам показал спад у мышей, которые находились на 10% гемицеллюлозной диете (Такенака и Итояма, 1993). Модифицированный арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей показал свою эффективность при усилении активность естественных-киллеров после перорального приема BioBran (MGN-3) у человека. Альфа-глюкан, полученный из рисовых отрубей обладает потенциальным противоопухолевым действием, в то же время различные полисахариды, принадлежащие к группе бета-глюканов, полученных из грибов, таких как Lentinus (Шиитаке), Schizophyllum (Щелелистник) и Grifola (Грфиола) отвечают за противоопухолевый эффект.

Полученные результаты не показывают, что компоненты рисовых отрубей в слизистой были абсорбированы. Это первая попытка показать, что иммунореактивные компоненты BioBran в отношении полипептидов и полисахаридов определенно абсорбировались из сыворотки в кровь после перорального приема препарата.

Ранее уже сообщалось, что BioBran являются эффективными при понижении сывороточных липидов и оказывает влияние на вкусовые предпочтения у крыс с диабетом, индуцированным стрептозотоцином. Это потенциально полезное действие BioBran в борьбе с таким побочным эффектом цисплатина, как рвота. Не смотря на то, что пока не известно, как BioBran может сыграть положительную роль в защите против потери веса, вызванной приемом цисплатина, результаты, которые мы получили способствуют дальнейшему проведению клинических исследований препарата, в качестве, так называемого, функционального питания для подтверждения их защитного действия и улучшения качества жизни у пациентов с поздними стадиями рака. Необходимо дальнейшее выявление характеристик компонентов BioBran для достижения наилучшего противоракового эффекта, а также защитного эффекта против побочных эффектов химиопрепаратов.

Рисунок 4. Для того чтобы обобщить данные по иммунореактивным веществам BioBran в сыворотке мышей после перорального их приема, значения OD до и час спустя после перорального приема показывают тот же уровень, что означает отсутствие иммунореактивных веществ BioBran в сыворотке, зачем следует спад значения OD, что указывает на их присутствие в сыворотке мышей через 2 и 3 часа после перорального приема. Спад сывороточных титров поликлональных антител к BioBran являлся статистически значимым (критерий Уилкоксона Р<0.01).

Оригинальная версия статьи