Модифицированный арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей (MGN-3\BioBran) усиливает фагоцитоз

М. Гонеум (США), М. Матсара (Япония), С. Голлапади (США)

Аннотация

Фагоциты, состоящие из нейтрофилов и моноцитов/макрофагов, играют важную роль в реакции врожденного иммунитета против воздействия инфекций. Наше предыдущее исследование показало, что арабиноксилан из экстракта рисовых отрубей (BioBran) активирует перитонеальные макрофаги у мышей, а также клеточные линии макрофагов. В данном исследовании мы изучали, может ли BioBran активировать фагоциты человека в периферической крови к кишечной палочке, инициируя оксидантную реакцию и производя цитокины. Фагоцитарные клетки были маркированы дихлорофлуоресцин диацетатом и инкубированы с кишечной палочкой меченной фикоэритрином в присутствии BioBran или без него. Фагоцитоз и оксидантная реакция оценивались посредством проточной цитометрии. Результаты показали, что лечение BioBran усиливает фагоцитоз кишечной палочки нейтрофилами и моноцитами. Это было связано с повышенной оксидантной реакцией. Кроме того, лечение вызвало значительную индукцию цитокинов (фактор некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10). Эффект был достигнут при дозе 1 µг\мл и увеличивался в зависимости от дозы (Р≤0.01). Примечательно, что применение только BioBran не оказало никакого эффекта на рост 31 бактериального штамма, из чего можно предположить, что BioBran модулирует фагоцитарную клеточную функцию. Полученные результаты можно применять в лечение инфекционных заболеваний у людей пожилого возраста и у пациентов с ослабленным иммунитетом.

Фагоцитарные клетки, как нейтрофилы и макрофаги, являются важными компонентами врожденной иммунной системы, которые необходимы для успешного устранения инфекции. Фагоцитарная функция основана на клеточной активации, характеризующейся фагоцитозом, активацией оксидантной реакции и производством провоспалительных цитокинов. Встреча фагоцитарных клеток с бактериями активирует эти клетки, что приводит к очищению организма от патогенов. Стимулированные макрофаги могут синтезировать и освобождать самые разные цитокины, в том числе провоспалительные и антивоспалительные цитокины. И эти цитокины играют важную роль в формировании адаптивных иммунных реакций. Нарушения функций фагоцитарных клеток связаны с повышенной восприимчивостью к инфекциям. Следовательно, агенты, которые стимулируют функциональную активность фагоцитов имеют очень ценное значение для лечения инфекционных заболеваний.

Многие натуральные продукты имеют способность активировать макрофаги. Сюда входят: а) водоросли, как синезеленая водоросль Aphanizomenon flos-aquae; b) растения, как женьшень обыкновенный, сбор китайских трав и ширококолокольчик крупноцветковый, ферментированная папайя; с) грибы, например, лентинан, изолированный из грибов шиитаке, продигиозан и шизофиллан из щелелистника обыкновенного и d) бактерии, как Бацилла Кальметта-Герена. Многие полисахариды, извлеченные из этих грибов и микробов имеют иммуномодулирующую функцию благодаря бета 1,3-глюкан. BioBran – это полисахарид, полученный из экстракта рисовых отрубей, который, как было доказано, является новым модификатором биологического ответа. Пероральный прием BioBran усиливает активность NK-клеток и размножение Т- и В-клеток. Так как исследование в естественных условиях показало, что BioBran повышает фагоцитарную активность макрофагов у мышей, данное исследование имеет своей целью изучить способность BioBran усиливать функции фагоцитов человека и исследовать механизмы, лежащие в основе этого эффекта. Результаты показывают, что BioBran оказывает стимулирующий эффект на фагоцитарные клетки человека и усиливает оксидантную реакцию и производство цитокинов (фактор некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10).

Материалы и методы

Химические препараты и бактерии

Левофлоксацин в виде порошка (в качестве положительного контрольного препарата); фиколл-гипак (Pharmacia, Uppsala, Швеция); дихлорофлуоресцин диацетат (DCFH-DA) и дигидрородамин 123 (DHR) от Molecular Probes (Юджин, Орегон); форбол миристат ацетат (PMA), желатин, глюкоза и Пропидий йодид (PI) (Сэнт Луис, Миссури); сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без фенолового красного от GIBSCO (Гранд Айленд, Нью-Йорк); кишечная палочка из Американской Коллекции Тканевых Культур (ATCC) 25922; синегнойная палочка из ATCC 27853; стафилококк золотистый ATCC 29213; и энтерококки ATCC 29212.

Среда

Полная среда (CM) состояла из RPMI-раствора 1640 с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS), 2 ммоль глутамина и 100 µг\мл стрептомицина и пенициллина.

BioBran

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей с помощью энзимов гриба шиитаке. Он содержит полисахариды (ß-1,3-глюкан и активированную гемицеллюлозу) (Daiwa Pharm., Co., Ltd., Япония).

Применялась культура BioBran с бактериями: Среда Мюллера-Хинтона c TES (катионный питательный бульон) (25 мг\л Cа ++ и 12.5 мг\л Mg ++). Уровень pH замерялся после автоклавирования и подгонялся к показанию 7.2-7.4 при необходимости.

Бактерии меченные пропидий йодидом

Кишечная палочка, выращенная в пептонной воде в течение ночи была отмыта три раза в сбалансированном солевом растворе Хенкса без фенолового красного, зафиксирована и пермеабилизированна с 70% этанола при температуре 40 °C в течение 30 минут. Затем клетки были промыты 2 раза в физиологическом растворе, забуференным фосфатом с содержанием 1% желатина и 1% глюкозы (PBSg) и повторно суспендированы до конечной концентрации 10⁸ организмов на мл посредством измерения оптической плотности (580 нм) в спектрофотометре. Бактерии были инкубированы с пропидием йодидом (PI) при конечной концентрации 50µг\мл в течение 30 минут. Меченные бактерии были отмыты и повторно суспендированы в PBSg (10⁸ \мл).

Фагоцитоз

Цельная кровь (1 мл) от трех испытуемых была инкубирована с кишечной палочкой меченной PI на 1 час при температуре 37°C в присутствии BioBran (100µг\мл) или без него. Поглощение бактерий нейтрофилами и моноцитами\макрофагами определялось при помощи проточного цитофлюометра FACScan. Прямое и боковое светорассеяние применялось для выделения гейта моноцитов и нейтрофилов. Было приобретено 10 000 клеток и проведен анализ при помощи программного обеспечения Cellquest Softaware Programme (BD Biosciences, Сан-Хозе, Калифорния).

Продукты оксидантного формирования (ROS, реактивные кислородные агенты)

Внутриклеточное производство перекиси водорода измерялось при помощи флуоресценции DCFH-DA. DCFH-DA пропускает клетки и является неполярной молекулой. Внутри клеток группы ацетила расщепляются клеточными ферментами в цитоплазме, чтобы произвести полярную молекулу DCFH, а затем заключить внутрь клеток. DCFH-DA – это нефлуоресцентная молекула, но ее окисление выпускает флуоресцентную молекулу, которая сразу же выявляется при помощи проточной цитометрии. Для загрузки клеток цельная кровь (1 мл) 5 испытуемых была инкубирована с 5 µМ DCFH-DA на 15 минут при температуре 37°C. Затем клетки промыли в PBSg и инкубировали с BioBran (100 µг\мл) на 1 час. Флуоресценция DCFH была выявлена при помощи FACScan.

Производство цитокина (фактор некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10)

Мононуклеарные клетки периферической крови трех испытуемых в полной среде были культивированы в 24 луночном планшете в присутствии BioBran (100µг\мл). Супернатант культуры (над осадочная жидкость) был получен через 6 часов после стимулирования и изучен на предмет фактора некроза опухолей альфа. Через 24 часа были получены супернатанты интерлейкина-6, интерлейкина-8, интерлейкина-10. Цитокины в над осадочной жидкости измерялись при помощи твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) в соответствии с инструкциями производителя (Endogen, Woburn, MA). Количественное определение цитокинов производилось на основе стандартной кривой.

Клеточные линии макрофага человека (клетки U937)

Клетки U937 в полной среде были заранее культивированы с PMA (60 нг\мл) в течение 3 дней в 24 луночном планшете (2.5 х 10⁵\0.6мл\на лунку), чтобы индуцировать дифференциацию в макрофагоподобные клетки. Примыкающие клетки были культивированы с BioBran (1-1000 µг\мл) и цитокины в над осадочной жидкости были измерены при помощи ELISA, что было описано выше.

In vitro активность BioBran на фоне избранных аэробных и микроаэробных бактерий

Мы провели исследование активности по времени гибели с BioBran при помощи стандартной процедуры, описанной в пособии Клиническая Микробиологическая Процедура, раздел 5.16.14. Концентрации BioBran -3 64, 256 и 1024 µг\мл были приготовлены в среде Мюллера-Хинтона c TES (катионным питательным бульоном). Уровень pH растворов измерялся в начале исследования и во время отбора проб. BioBran и Левофлоксацин, используемый в качестве положительного контрольного препарата, были добавлены в колбы, содержащие 10 мл нагретого CSMB. Колбы были инокулированны штаммом примерно до 5 х 10⁵ – 1 х 10⁶ КОЕ\мл. Колбы, не содержащие препарат, были включены в исследование в качестве контрольных. Инкубация происходила при температуре 37°C в аэробных условиях в течение 24 часов. Небольшая аликвотная часть была отобрана в начальный момент и разбавлена, чтобы задать начальную концентрацию штамма. Из всех колб была взята проба после 2, 4, 8 и 24 часов инкубационного периода, затем разбавлена в 10 или 100 раз и помещена в лунки для определения количества бактерий (КОЕ\мл). Уровень pH был измерен и зафиксирован в каждый указанный период времени. Левофлоксацин был протестирован в 0.03 µг\мл на наличие кишечной палочки, в 2 µг\мл на синегнойную палочку, в 0.25 µг\мл на стафилококк золотистый и в 1 µг\мл на энтерококки.

Рисунок 1. Репрезентативная гистограмм лизированной периферической крови в цитофлуорографе FACS, прямое и боковое светорассеяние разных популяций фагоцитов; полиморфонуклеарные лейкоциты, моноциты

Статистический анализ

Все эксперименты повторялись, по крайней мере, три раза. T-критерий Стьюдента применялся для оценки статистической значимости различий результатов. Уровень достоверности <0.05 рассматривался, как статистически значимый.

Рисунок 2. Влияние BioBran на фагоцитарную активность полиморфонуклеарных лейкоцитов и моноцитов. Целая кровь (1 мл) была инкубирована с кишечной палочкой меченной PI на 1 час при температуре 37 °C в присутствии BioBran (100 µг\мл) или его отсутствии. Поглощение бактерий фагоцитарными клетками определялось при помощи FACScan. Данные представляют среднее стандартное отклонение от 3 испытуемых. *Р<0.01 по сравнению с клетками+кишечная палочка.

Рисунок 3. Репрезентативный проточный цитограф оксидантной реакции в нейтрофилах и моноцитах, культивированных с кишечной палочкой в присутствии или без BioBran. Оксидантная реакция контролировалась измерением производства перекиси водорода при помощи окраски DCFH и FACScan. Целая кровь (1 мл) была инкубирована с 5µМ DCFH-DA в течение 15 минут с BioBran (100 µг\мл) в течение 1 часа. Флуоресценция DCFH была выявлена при помощи FACScan. Данные представляют 5 отдельных испытуемых.

Рисунок 4. Влияние BioBran на оксидантную реакцию в полиморфонуклеарных лейкоцитах и моноцитах. Оксидантная реакция контролировалась измерением производства перекиси водорода при помощи окраски DCFH и FACScan. Данные представляют 4отдельных испытуемых.

Результаты

Фагоцитоз

Гистограмма лизированной периферической крови в цитофлуорографе FACS, показала прямое и боковое светорассеяние разных популяций фагоцитов; полиморфонуклеарные лейкоциты, моноциты и лимфоциты показаны на Рисунке 1. Целая кровь была инкубирована с кишечной палочкой меченной PI в присутствии BioBran (100 µг\мл) или его отсутствии. Поглощение бактерий фагоцитарными клетками определялось при помощи FACScan. Лечение с BioBran значительно усилило фагоцитоз кишечной палочки фагоцитарными клетками, полиморфонуклеарные лейкоциты 400% (Рисунок 2А) и моноциты 110% (Рисунок 2В) в сравнении с (клетками + кишечная палочка).

Влияние BioBran на оксидантную реакцию

Оксидантная реакция в нейтрофилах и моноцитах контролировалась посредством измерения производства перекиси водорода при помощи окраски DCFH и FACScan. PMA применялся в качестве положительного контрольного препарата для определения оксидантной реакции. Рисунок 3 показывает репрезентативный проточный цитограф оксидантной реакции в нейтрофилах и моноцитах, культивированных с кишечной палочкой в присутствии или без BioBran. В присутствии кишечной палочки BioBran усилил оксидантную реакцию в нейтрофилах и моноцитах. Данные на Рисунке 4 показывают, что BioBran без других препаратов не оказывает влияния на генерацию оксидантной реакции ни в одной из фагоцитарных клеток.

Влияние BioBran на производство цитокинов (фактор некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10)

Эксперименты проводились целью определения влияния BioBran на производство цитокинов из мононуклеарных клеток и U937 клеток периферической крови человека. Клетки культивированы с BioBran (1-1000 µг\мл), также были получены супернатанты клеточной культуры через 6 и 24 часа и после проведена оценка производства фактора некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10 при помощи ELISA. Данные, отображенные на Рисунке 5 показывают, что лечение BioBran вызвало значительное усиление производства данных цитокинов мононуклеарными клетками и U937 клетками периферической крови человека (Р≤0.01). Это было выявлено при 1 µг\мл и выше в зависимости от дозы, которая была значима при концентрациях 10 µг\мл и выше (Р<0.01). Для того чтобы исключить возможность, что причиной повышенного производство цитокинов была смерть клеток и высвобождение этих цитокинов, мы исследовали влияние BioBran на жизнеспособность моноцитов при помощи FACScan. Данные показывают, что жизнеспособность клеток, культивированных с BioBran (87%) была аналогичной клеткам из контрольной группы (90%).

Рисунок 5. Влияние BioBran на производство цитокинов из мононуклеарных клеток и U937 клеток периферической крови человека. Клетки были культивированы с BioBran (1-1000 µг\мл) на 24 часа. Была проведена оценка производства фактора некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8, IL-10 при помощи ELISA. Результаты представляют среднее стандартное отклонение от образцов в трех экземплярах. *Р<0.01 по сравнению с супернатантом без BioBran.

In vitro активность BioBran на фоне избранных аэробных и микроаэробных бактерий

Сложное вещество обычно считается бактерицидным, если начальный инокулят сокращается на 3 log_10, то есть с 10⁵ до 10² КОЕ\мл. была построена кривая      эрадикация (4 штамма, каждый в трех концентрациях BioBran; 1 Левофлоксацин; 1 контроль роста без препаратов = 5 пробирок). Данные в таблице 1 показывают отсутствие активности BioBran на фоне широкого спектра анаэробных и микроаэробных бактерий при измерении методом разведений в агаре.

Таблица 1. In vitro активность BioBran на фоне избранных анаэробных и микроанаэробных бактерий

Дисскусия

BioBran извлекается из экстракта рисовых отрубей и производится путем частичного гидролиза растворимой фракции гемицеллюлозы. Главная химическая структура BioBran – это арабиноксилан с ксилозой в основной цепи и полимер арабиноза в боковой цепи. BioBran обладает противоопухолевым действием, сенсибилизируя лейкемические клетки человека к рецептору апоптоза [CD95] и действует синергически с дрожжами, для индуцирования апоптоза в клетках рака. Кроме того, BioBran проявил себя, как новый модификатор биологического ответа, который усиливает активность NK-клеток и размножение Т- и В-клеток. Так как исследование в естественных условиях показало, что BioBran повышает фагоцитарную активность макрофагов у мышей, данное исследование имеет своей целью изучить способность BioBran усиливать функции полиморфонуклеарных лейкоцитов и моноцитов. BioBran усиливает фагоцитоз кишечной палочки фагоцитарными клетками человека и усиливает оксидантную реакцию, индуцированную фагоцитозом. Более того, BioBran инициирует секрецию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Оксидантная реакция в фагоците приводит к генерации активных форм кислорода, таких как супероксид-анион, которые являются мощными антимикробными веществами. В данном исследовании мы выявили, что BioBran не обладает прямым действием подавления бактерий. Однако он может повышать внутриклеточное подавление за счет ROS (реактивных кислородных агентов). При активации с помощью BioBran,  мононуклеарные клетки периферической крови и моноцитарные клеточные линии U937 произвели несколько цитокинов с биологическим действием широкого спектра. Эти цитокины порождают либо воспалительный (фактор некроза опухолей альфа, IL-6, IL-8), либо противовоспалительный ответ (IL-10). Воспаление – это ответ организма хозяина на воздействие инфекции для избавления от инвазивных организмов. Неконтролируемое воспаление приводит к повреждению ткани. Следовательно, агенты, которые стимулируют производство обоих типов цитокинов очень важны для быстрого устранения инфекции.

Что касается эффекта BioBran на клеточную линию U937, с момента самых ранних опубликованных исследований, произошли изменения, относительно производства цитокинов фактор некроза опухолей альфа и IL-6. Это может объясняться различными применяемыми методами: U937 были прекультивированны при помощи PMA без дигидроксивитамина D3, который применялся в ранних экспериментах.

Еще предстоит изучить точные механизмы, при помощи которых BioBran стимулирует активность макрофагов. BioBran – это полисахарид, содержащий ß -1,3-глюкан и может выполнять функции многих других полисахаридов, полученных из натуральных источников (клеточные стенки грибов и некоторых бактерий), которые имеют ß -1,3-глюкан и могут модулировать врожденный иммунитет посредством привязывания к конкретным рецепторам на моноцитах\макрофагах и нейтрофилах. Результаты нашего исследования показали, что BioBran отдельно стимулирует только производство цитокина, но не вызывает оксидантную реакцию в фагоцитарных клетках, можно предполагать, что сигнальные механизмы для производства цитокинов независимы от оксидантной реакции.

Мы пришли к выводу, что BioBran оказывает усиливающий эффект на антибактериальное действие фагоцитарных клеток человека. Эти данные могут говорить о терапевтических свойствах BioBran, как антимикробного агента для лечения пожилых людей.

Оригинальная версия статьи