NK-клетки; восстановление иммунного гомеостаза больных раком с помощью BioBran (исследование 32 пациентов, наблюдавшихся в течение 4 лет)

14 Июнь 2000

Аннотация

NK-клетки характеризуются как не В-клетки и не Т-клетки, лишённые характеристик зрелых макрофагов, которые развиваются из клеток костного мозга независимо от влияния тимуса. NK-клетки играют решающую роль в гибели опухоли, иммунологическом надзоре, сопротивляемости инфекциям и иммунном регулировании процессов организма. Разрушение нормальными киллерами раковых клеток включает в себя определенную последовательность событий. Во-первых, клетка NK распознает раковую клетку и привязывается к ней. Этот процесс требует межрецепторного взаимодействия. NK-клетка выделяет гранулы, которые проникают в раковую клетку и в конечном итоге убивают ее. После чего NK-клетка освобождается для привязки к другой раковой клетке и процесс повторяется.

Однако раковые клетки знают, как вести своего рода клеточную войну. Мы впервые в нашей лаборатории открыли, что раковые клетки могут уничтожать лейкоциты посредством фагоцитоза. Мы наблюдали три способа, которыми это делается. Раковая клетка может окружить с двух сторон лейкоциты или может создать чашеобразное отверстие, внутрь которого затягиваются лейкоциты. Третий способ заключается в том, что раковая клетка вытягивает длинное плечо, чтобы захватить лейкоцит и, в конце концов, затянуть его внутрь раковой клетки, где он переварится. Кроме того, другие работы показали, что раковые клетки выделяют иммуносупресивные вещества, которые ослабляют функцию иммунной системы.

За последние 25 лет были сделаны многочисленные попытки укрепления иммунной системы с помощью различных модификаторов биологической реакции (МБР). Эти вещества, создаются из бактерий и грибков, которые обладают иммунорегуляторными свойствами. Кроме того, некоторые виды цитокинов работают подобно МБР, например, интерфероны, интерлейкин-2 и интерлейкин-12. Есть две проблемы, связанные с этими МБР: 1) токсичность, 2) развитие низкой реактивности, при которой однократное введение МБР может значительно повысить активность клеток NK, но повторное введение того же МБР приведет к депрессии активности NK-клеток. Интересно отметить, что BioBran имеет преимущества перед другими МБР. Он нетоксичен и не показал низкой реактивности за четыре года наблюдений. Настоящая работа была проведена с целью изучения влияния нового МБР, известного под названием BioBran, на функцию NK-клетки и пролиферацию Т-и В-клеток у 32 пациентов. У отдельных пациентов были зарегистрированы опухолевые антигены.

Пациенты

Настоящее исследование проводилось на 32 пациентах страдающих от раковых заболеваний. У пациентов были различные типы опухоли: простаты, молочной железы, множественная миелома и лейкемия. Большинство пациентов прошли через циторедукцию при помощи традиционных видов терапии, таких как хирургическое вмешательство, лучевая терапия или химиотерапия.

Материалы

BioBran – это арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, обработанный под воздействием ферментов из грибов шиитаке. Это полисахарид, который содержит гемицеллюлозу. Торговое название BioBraп – BioBran MGN-3 (компания Daiwa Pharmaceuticals, Co., Ltd., Токио, Япония).

Методы

Протокол лечения. Пациентами давали BioBran (3 г в день) ежедневно перорально.

Опухолевый специфический антиген (ОСА). ОСА для каждого типа опухоли измерялся до начала лечения препаратом BioBran и через месяц после лечения.

Линия опухолевых клеток. К562, клетки эритролейкемической линии человека, использовались в качестве целевой. Опухолевые клетки культивировались в полной среде, состоящей из RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% антибиотика (100 единиц пенициллина и 100 г\мл стрептомицина).

Препарат лимфоцитов периферической крови (ЛПК). ЛПК были приготовлены из свежей гепаринизированной венозной крови путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Клетки были два раза промыты сбалансированным солевым раствором Хенкса и ресуспендированы до концентрации 10 х 106 кл\мл в общей среде.

51CR – анализ для измерения активности NK-клеток. Активность нормальных киллеров измерялась стандартным 4-х часовым 51CR- анализом. Вкратце, 1х104 опухолевые целевые клетки, меченные Cr в 0.1 мл обшей среды добавлялись в различные лунки 96-луночного титрационного планшета. Затем клетки-эффекторы пипеткой переносились в ячейки в 4 копиях, чтобы получить соотношение клеток-эффекторов к целевым клеткам (E:T) 12:1, 25:1, 50:1 и 100:1. После 4 часового инкубационного периода при температуре37 °C, планшеты были центрифугированы (1 400 об\мин в течение 5 минут) и было собрано 0.1 мл центрифугата из каждой лунки и пересчитано по гамма-счетчику (Beckmann G50, Beckmann Instruments).

Процент освобождённых изотопов рассчитывался по следующей формуле:

Спонтанное освобождение из целевых клеток составило не боле 8-10% от общего освобождения. Общее освобождение измерялось прибавлением 0.1мл Тритона Х-100 (Sigma Chemical Co.) в назначенные лунки. Единицы лизиса рассчитывались из кривых титрования эффектора с одной определённой единицей лизиса, так как требовалось, чтобы количество клеток-эффекторов достигло 20% лизиса для К562.

Гранулярность естественных киллеров. Выделение лимфоцитов периферической крови в градиенте перколла было настроено на 2.5=10.6\мл и центрифугировано на слайдах при 1 000 об\мин в течение 5 минут при помощи цитоцентрифуги (Shanton Southern Institute, Сеуикли, Пенсильвания). Слайды были высушены в воздушной сушке, фиксированы метанолом, окрашены 5% раствором Гимзе в течение 10 минут. Окрашенные препараты были изучены на предмет гранулярности NK-клеток.

В естественных условиях пролиферация T-лимфоцитов и В-лимфоцитов. Мы исследовали влияние в естественных условиях BioBran на пролиферацию Т-клеток и В-клеток при помощи [3H]тимидина. Мононуклеарные клетки были подготовлены из периферической крови пяти раковых пациентов до лечения BioBran и через месяц после лечения. Клетки были инкубированы при 2х105 кл\мл в общей среде. Клетки были обработаны фитогемагглютинином (10г\мл), конканавалином А или митогеном лаконоса в течение 3 дней. На последние 18 часов к культурам клетки был добавлен меченый тритием тимидин. Были собраны образцы ДНК и определено накопления тимидина при помощи сцинтиллоскопа. Все эксперименты проводились в трех повторениях, данные выражены, как число импульсов в минуту.

Статистический анализ. Т-критерий Стьюдента применялся для изучения значимости отклонений между активностью NK-клеток и реакцией Т- и В-клеток на митогены до и после лечения препаратом BioBran.

Результаты

1. Активность NK-клеток

Рисунок 1 показывает базовые значения цитотоксичных ответов NK-клеток у 32 пациентов, больных раком. У пациентов отмечался общий низкий уровень функции NK-клеток. Депрессия активности NK-клеток наблюдалась у пациентов с разными типами опухолей: простаты, 11.1 единиц лизиса; молочной железы 11.4 единиц лизиса; множественная миелома, 7.3 единиц лизиса; лейкемия 4.3 единиц лизиса. Исследования лимфоцитов периферической крови у 12 участников спустя 1-2 недели после первичного исследования, не выявили статистически значимых различий в активности NK-клеток по сравнению с первоначальными результатами. Лечение MGN-3 показало значительное повышение активности NK-клеток до десяти раз. Усиливающий эффект MGN-3 был выявлен при всех типах опухолей: простаты 41.9 единиц лизиса; молочная железа 33 единиц лизиса; множественная миелома 31.9 единиц лизиса; лейкемия 51.4 единиц лизиса.

Рисунок 1. Влияние BioBran на активность NK-клеток у 32 пациентов от одной до двух недель после лечения. Типы опухолей: простата (10), молочная железа (12), множественная миелома (5), лейкемия (5). Единицы лизиса при 20% *р < 0.001

2. Гранулярность NK-клеток.

Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови до лечения показала низкую гранулярность или ее отсутствие (рис.2а).

Рисунок 2(а). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови. NK-клетки были взяты от ракового пациента до начала лечения BioBran. Обратите внимание на ядерно-плазменное отношение и отсутствие гранул.

Рисунок 2(b). Препарат цитоцентрифугирования лимфоцитов периферической крови того же пациента через 1 неделю после лечения BioBran. Клетки демонстрируют высокое гранулярное содержание.

С другой стороны, лечение BioBran показало значительное повышение гранулярного содержания через 1 неделю после лечения (рис. 2b). Активированные BioBran NK-клетки показали повышение связывающей способности и способности уничтожать раковые клетки (рис. 3).

Рисунок 3. Препарат цитоцентрифугирования опухолевой клетки К562. NK-клетки были активированы BioBran. (а) Первый шаг процесса представлен связыванием NK-клетки к клеткой опухоли. (b) Одна опухолевая клетка мертва. (с) Обе опухолевые клетки мертвы, а NK-клетка все еще активна. (d) NK-клетка самостоятельно отделяется от мертвых опухолевых клеток.

3. Пролиферация в естественных условиях Т- и В-лимфоцитов

Рисунок 4 показывает, что лечение BioBran значительно повысило пролиферацию Т-клеткок, это показывает реакция на митогены: фитогемагглютинин и конканавалин А. Пролиферация В-клеток также повысилась после лечения BioBran, о чем свидетельствует реакция на митоген лаконоса, по сравнению с базовым значением.

PHA – фитогемагглютинин, Con A - конканавалин А, PWM - митоген лаконоса

Рисунок 4. Действие BioBran в ответ на митоген. Т- и В-клетки через месяц после лечения. Мононуклеарные клетки были культивированы из периферической крови в присутствии фитогемагглютинина, конканавалина А и митогена лаконоса. Данные представляют среднее значение (стандартное отклонение у пяти человек.) *р<0.001.

4. ОСА и активность естественных киллеров у отдельных пациентов

Пациентов проверили на предмет опухолевого специфического антигена: простата, простат специфический антиген (ПСА); множественная миелома, белок Бен-Джонса (ББД) или ICg. Рак молочной железы проверялся при помощи РЭА и КТ сканирования от одного до двух раз в год. Был проведен анализ различных типов злокачественных опухолей у отдельных пациентов.

Пациент К, 39 лет. Был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Была проведена химиотерапия, в результате которой число лейкоцитов составило 5.6, при норме от 4.5 до 10.5. Химиотерапия была прекращена и пациент начал принимать BioBran в январе 1995 года. Показатели лейкоцитов оставались в норме с того времени. Активность NK-клеток пациента составила 7.9 единиц лизиса и повысилась до 113 единиц лизиса через одну неделю после лечения BioBran. Уровень активности NK-клеток остается высоким уже в течение 4 лет.

Пациент Y, 52 года, менеджер магазина из Японии. Ему также был поставлен диагноз острый миелогенный лейкоз. Он отказался от традиционного лечение. Количество лейкоцитов 31 марта 1998 года составило 18 700\мл. Пациент начал принимать BioBran.и 30 апреля число лейкоцитов упало до 11 000. С того времени его состояние остается стабильным.

В 1994 году R обратился к нам по поводу рака простаты. Гормональная терапия привела к тому, что уровень ПСА был 0.1, но известно, что маркёр со временем снова повышается. Пациенту начали давать BioBran.и уровень ПСА остается в норме последние 4 года.

М, пациентка, у которой возник рецидив рака молочной железы в апреле 1995 года. До этого ей была проведена операция, за которой последовала химиотерапия. Она начала прием BioBran после завершения курса химиотерапии и с тех пор компьютерная томография показывала хорошие результаты. Больше не было признаков рецидива заболевания, согласно компьютерной томографии и биопсии. Активность NK-клеток пациентки составила 16.4 единицы лизиса. Это увеличенные в два раза показатели после одной недели лечения BioBran. Активность продолжала увеличиваться до 128 единиц лизиса и остается на высоком уровне в последние годы.

Обсуждение

BioBran считается сильным модификатором биологического ответа, о чем свидетельствует повышенная активность NK-клеток у животных и человека. Интраперитонеальная инъекция мышам BioBran показала повышение активности NK-клеток в несколько раз через два дня после лечения. Другие исследования на крысах, в которых BioBran применялся вместе с пищей, также показал повышение активности NK-клеток в зависимости от применяемой дозы. Исследования проводились и на здоровых участниках, которые принимали BioBran перорально. Повышение активности NK-клеток в 2-3 раза наблюдалось через неделю после лечения BioBran в дозе 30 и 45 мг\кг в день, а более низкие дозы 15 мг\кг в день показали повышение активности в два раза только через месяц.

По нашему мнению, особенный интерес представляет исследование стимулирующего влияния BioBran на активность NK-клеток у пациентов с наличием злокачественного новообразования. Пациенты прошли химиотерапию и лучевую терапию, так как требовалась циторедукция. Однако в результате этих воздействий активность естественных киллеров снижалась. Учитывая потребность организма в естественном иммунитете, мы поняли, что усиление активности NK-клеток может оказаться клинически крайне важным для уничтожения оставшихся раковых клеткок, которые не были уничтожены во время лучевой и химиотерапии. Возможно усилить активность NK-клеток за счет применения различных модификаторов биологического отклика. Однако токсичность и низкий иммунологический ответ ограничивают их применение. BioBran является безопасным продуктом, у пациентов не развивалась устойчивость к иммуному ответу на препарат во время 4 лет проведения исследования. За активностью NK-клеток велось наблюдение, чтобы можно было задокументировать все изменения в активности циркулирующих иммуноцитов во время терапии с данными препаратами. Было выявлено усиление активности NK-клеток благодаря BioBran уже через 1-2 недели после лечения, и эта активность удерживалась на высоком уровне при продолжении лечения BioBran.

Циторедукция, за которой следовала иммунотерапия BioBran применялась к 32 пациентам, больным раком. Кроме повышения активности NK-клеток, пациенты показали постепенное снижение уровня опухоль специфического онтигена без признаков увеличения в течение 4 лет, пока проводилось исследование.

Изучались механизмы, благодаря которым BioBran повышает активность NK-клеток. Согласно нашим исследованиям, два механизма отвечают за активность NK-клеток, вызванную BioBran. Во-первых, это происходит за счет гранулярности NK-клеток, во-вторых – за счет повышения производства цитокина. Что касается гранулярности, NK- клетки наших пациентов имели либо низкую гранулярность, либо ее полное отсутствие. Примечательно, что лечение BioBran значительно повышало гранулярное содержание NK-клеток (Рис. 2). Гранулы располагаются не только в порции цитоплазмы, но также и между ядерными и клеточными мембранами. Экзоцитоз гранул NK-клеток и секреция молекул, формирующих поры (перфорины), хранящиеся как цитоплазмические гранулы могут представлять один из важнейших механизмов для уничтожения клеток рака системой NK-клеток. Важная роль гранул при уничтожении опухолевых клеток NK-клетками была выявлена при наблюдении за изолированными и очищенными гранулами. Они обладают разлагающим воздействием на разные типы опухолевых клеток. Следовательно, мы полагаем, что повышенный уровень гранулярности NK-клеток является важным фактором для усиления клеточного ответа на гибель рака благодаря применению BioBran.

Что касается цитокинов, было выявлено, что сразу несколько цитокинов влияют на пролиферацию NK-клеток или на цитолитическую активность. Большему изучению подверглись интерфероны и ИЛ-2. Подавление активности NK-клеток у раковых пациентов была связана с недостаточным производством лимфокина. Предположительно, усиление цитотоксической функции NK-клеток за счет введения BioBran совпадает со значительным повышением уровней различных цитокинов. Грануляция больших гранулярных лимфоцитов может указывать на секреторную функцию. Пока не известно является ли производство различных лимфокинов полифункциональным свойством подгруппы больших зернистых лимфоцитов. Более вероятно, что различные подгруппы больших зернистых лимфоцитов ответственны за различные лимфокины. В лабораторных исследованиях было выявлено, что лечение BioBran значительно повышает производство ФНО-альфа и интерферонов. Кроме того, пациенты с различными типами злокачественных опухолей показали повышение уровней ИЛ-2, ИЛ-12, ФНО-альфа после лечения BioBran.

Наша работа показала первичный эффект BioBran на NK-клетки. Однако есть данные, полученные от здоровых контрольных участников исследования, что другие иммуноциты, Т- и В-клетки показали усиление своих функций после лечения. В данном исследовании мы выявили, что у пациентов были усилены функции Т- и В-клеток, как доказательство реакции пролиферации на разные митогены. Это доказывает, что BioBran вызывает общую стимуляцию иммунитета.

Предварительные результаты настоящего исследования достаточны для проведения дальнейших клинических исследований.

Оригинальная версия статьи