BioBran MGN-3, модифицированный арабиноксилан на основе экстракта рисовых отрубей повышает восприимчивость клеток рака молочной железы человека к воздействию даунорубицина

Аннотация

BioBran MGN-3, модифицированный арабиноксилан на основе экстракта рисовых отрубей является сильным модификатором биологического ответа (МБО). Предыдущие исследования показали, что BioBran MGN-3 повышает восприимчивость клеток лейкемии человека к рецептор-опосредованному апоптозу (CD95). [Ghoneum M., Gollapudi S. MGN-3 повышает восприимчивость Т-клеток лейкемии человека к рецептор-опосредованному апоптозу (CD95). Журнал Cancer Lett 2003; 201:41-9]. В данном исследовании мы оцениваем в лабораторных условиях усиливающее действие BioBran MGN-3 в борьбе с клетками рака молочной железы человека.

Методы: клетки рака (MCF-7 и HCCC70) были культивированы с разными концентрациями даунорубицина (от 1х10^-9 до 1х10^-6) в присутствии или отсутствии BioBran (100-1000 µг\мл) в течение трех дней. Выживаемость клеток рака молочной железы определялась МТТ-тестом, концентрация медицинских препаратов определялось проточной цитометрией.

Результаты: BioBran повышает восприимчивость клеток рака молочной железы к даунорубицину (DNR) (5.5-кратно для MCF-7 и 2.5-кратно для HCCC70), в сравнении с клетками рака молочной железы, подвергавшимися лечению только DNR. Усиливающий эффект BioBran был связан с повышенным накоплением DNR в раковых клетках.

Выводы: наши данные показывают, что BioBran является эффективным хемосенсибилизатором и может представлять потенциально новое средство для лечения рака молочной железы.

©Международное Общество Превентивной Онкологии. Опубликовано Elseiver Ltd. Все права сохранены.

Ключевые слова: Даунорубицин, проточная цитометрия, MСF-7, модификатор биологического ответа, хемосенсибилизатор, восприимчивость к препаратам, выживаемость клеток рака, противораковые препараты.

1. Введение

Химиотерапия считается краеугольным камнем в лечении злокачественных новообразований. Однако многие химиопрепараты показывают дозолимитирующую токсичность, которая включает: острую сердечную недостаточность, миелосупрессию, нейтропению, алопецию, мукозиты, диарею, миалгию, тромбоцитопению, нейротоксичность, подавление иммунитета, а также мутагенный и карциногенный эффекты. Кроме того, многие пациенты, лечившиеся химиотерапией, умирают от рецидива заболевания. Таким образом, представляет особый интерес исследование терапевтического подхода сокращения токсичности, вызванной химиотерапией. Использование химиопрепаратов вместе с безопасными, натуральными препаратами, которые эффективно снижают токсичность, может стать ответом на этот острый и не требующий отлагательств вопрос.

BioBran - это естественный продукт, получаемый при реакции гемицеллюлозы экстракта рисовых отрубей с гидролитическими ферментами грибав шиитаке. Главная химическая структура BioBran – это арабиноксилан с ксилозой в основной цепи и полимером арабиназой в боковой цепи. Ранее, было представлено действие BioBran, как сильного активатора естественных киллеров (NK-клеток) здорового человека и у пациентов, больных раком. Недавно мы продемонстрировали, что BioBran усиливает восприимчивость лейкемических клеток человека HUT 78 к апоптозу, индуцированному антителами к анти-CD95. В данном исследовании, мы исследуем способность MGN-3 сенсибилизировать химиопрепарат даунорубицин (DNR) к раковым клетках молочный железы человека и рассматриваем возможные механизмы, отвечающие за этот эффект.

2. Материалы и методы

2.1 Опухолевые клеточные линии и условия культивирования

Линии клеток рака молочной железы человека MCF-7 и клетки HCC70 использовались для проведения настоящего исследования. Клетки были приобретены у Американской коллекции тканей и клеток (ATCC), Манассас, штат Вирджиния. Опухолевые клетки хранились в нашей лаборатории в среде, которая состояла из питательной среды RPMI-1640, с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2µ глютамина и 100 µг\мл стрептомицина и пенициллина.

2.2 Препараты и химические реагенты

Компания Сигма (Sigma) предоставила даунорубицин и 3-[4.5-диметилтиазол2-yl]-2.5 дифенилтетразолиум бромид (MTT).

2.3 BioBran

BioBran – это денатурированная гемицеллюлоза, полученная при реакции гемицеллюлозы из экстракта рисовых отрубей с гидролитическими ферментами гриба шиитаке. Главная химическая структура BioBran – арабиноксилан с ксилозой в основной цепи и полимером арабиназа в боковой цепи. BioBran растворяли в среде при концентрации 30 мг\мл. BioBran MGN-3 предоставила компания Daiwa Pharmaceuticals Co. Ltd., Токио, Япония.

2.4 Проверка на чувствительность к медицинским препаратам

Чувствительность к препаратам определялась при помощи колориметрического MTT-теста. Этот тест основан на восстановлении бесцветной соли тетразолия  [3-(4.5-диметилтиазол3-yl]-2.5 дифенилтетразолиум бромид] митохондриальными дегидрогеназами живых метаболически активных клеток с образованием голубых кристаллов формазана, количество которого измеряется спектрофотометрически. Количество полученного формазана пропорционально числу активных клеток. Клетки (1х10⁴) помещали в лунки 96-луночного планшета в среде с присутствием лекарственных препаратов различных концентраций BioBran (100-1000 µг\мл) или без них и с выбранными концентрациями DNR (1х10^-9 до 1х10^-6 М) или без него. Конечный объем среды в каждой лунке после добавления BioBran и\или DNR составил 200 мл. Культивировали при температуре 37 °C в течение 3 дней, после чего было добавлен 50 мг MTT в каждую лунку и инкубация продолжалась еще 4 часа. Планшеты были центрифугированы, среда аккуратно удалена, кристаллы формазана \ были растворены в оксикислоте, а показания планшетов считывались при 590 мм при помощи тест-системы ELISA (Молекулярные устройства, Парк Менло, Калифорния). 50% ингибирующей концентрации (IC₅₀) было определено, как концентрация препарата необходима для 50% редукции активных клеток. IC₅₀ определялось логарифмом концентрации препарата в сопоставлении с уровнем выживаемости клеток, которые подвергались действию препарата.

2.5 Накопление даунорубицина

DNR – это флуоресцирующее вещество и его накопление в клетках изучалось проточной цитометрией, что мы описывали выше. Вкратце, клетки были инкубированы в присутствии 500 мг\мл BioBran или без него при температуре 37°C в течении 15 минут. Затем к клеткам добавили DNR (2µм), аккуратно перемешали и инкубировали при температуре 37°C 45 минут. Накопление DNR измерялось при помощи проточной цитометрии с использованием технологии FACScan (Бектон Дикинсон), интенсивность флуоресценции записывались в виде гистограмм, а данные были выражены на основании данных средней флюоресценции по каналам измерения.

Была выявлена кинетика при применении препарата BioBran. Клетки MCF-7 культивировались с добавлением DNR (2µм) в присутствии или отсутствии BioBran (500 мг\мл). Накопление препарата оценивалось через 15-ти минутные интервалы (от 0 до 60 минут) при помощи проточной цитометрии.

2.6 Статистический анализ

Статистическая значимость определялась по критерию Стьюдента. Отклонения были значимыми при р<0.05.

3. Результаты

3.1 Влияние BioBran на уровень выживаемости клеток рака молочной железы

Клетки рака молочной железы были культивированы вместе с BioBran (100-1000µг\мл) в течение 3 дней. Лечение MCF-7 клеток BioBran привело к значительному спаду выживаемости клеток в зависимости от дозы. Данные на Рисунке 1А показывают процентное соотношение выживаемости MCF-7 клеток, где 75%, 70% и 63% являются данными после применения BioBran в концентрациях 100, 500 и 1000 µг\мл, соответственно. С другой стороны, реакция HCC70 клеток на апоптотический эффект BioBran была менее очевидна (Рис. 1Б).

3.2 Влияние BioBran на восприимчивость раковых клеток молочных желез к DNR

Клетки рака молочной железы были культивированы вместе с DNR при разных уровнях концентрации (от 1х10^-9 до 1х10^-6) в присутствии или отсутствии концентраций BioBran (100-1000 µг\мл) в течение трех дней. Затем определялись значения выживаемости клеток и IC₅₀. DNR, как и ожидалось, ингибировал выживаемость MCF-7 клеток в зависимости от дозы. IC₅₀ у DNR был 1 µм. Однако, когда MCF-7 клетки были культивированы вместе BioBran и DNR, IC₅₀ у DNR против MCF-7 клеток оказался значительно сокращен (IC₅₀ 0.2 µм). Данные на Рисунке 2А показывают, что BioBran при концентрациях 100, 500 и 1000 µг\мл сокращал DNR IC₅₀ у MCF-7 клеток троекратно, пятикратно и в 5.5 раз, соответственно, по сравнению с использованием только DNR. BioBran также повышал восприимчивость HCC70 клеток к DNR, но в меньшей степени, если сравнивать с MCF-7 клетками. Данные на Рисунке 2Б показывают, что BioBran сокращал DNR IC₅₀ у HCC70 клеток в 2.5 раза.

Рисунок 1. Эффект действия BioBran на выживаемость клеток рака молочной железы. MCF-7 и HCC70 клетки (1х10⁴ ) помещали в лунки 96-луночного планшета и культивировали в присутствии или отсутствии различных концентраций (100-1000 µг\мл) BioBran в течение 3 дней, и выживаемость клеток определялась MTT-тестом. Выживаемость клеток показана как процент контроля. (А) MCF-7 клетки: данные представляют среднее ± стандартное отклонение от шести экспериментов, каждый эксперимент в трех повторах. (Б) HCC70 клетки: данные представляют  среднее ± стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый эксперимент был проведен в трех повторах.*р < 0.01, по сравнению с контролем клеток, которые не подвергались воздействию препарата.

Рисунок 2. Эффект BioBran на цитотоксичность DNR в клетках рака молочной железы. MCF-7 и HCC70 клетки (1х10⁴) помещали в лунки 96-луночного планшета с DNR (от 1х10^-9 до 1х10^-6М) в присутствии или отсутствии различных концентраций (100-1000 µг\мл) BioBran в течение 3 дней, выживаемость клеток определялась MTT-тестом. (А) MCF-7 клетки: данные представляют среднее ± стандартное отклонение от шести экспериментов, каждый эксперимент был проведен в трех повторах. (Б) HCC70 клетки: данные представляют  среднее ± стандартное отклонение от трех экспериментов, каждый эксперимент был проведен в трех повторах.

3.3 Эффект BioBran на накопление DNR в клетках рака молочной железы

Для определения, связано ли наблюдаемое повышение цитотоксичности DNR с BioBran, мы изучили накопление DNR при помощи проточной цитометрии. Результаты показывают, что BioBran, при концентрации 500µг\мл, значительно повышает накопление DNR в MCF-7 клетках (Рис. 3А) и HCC70 клетках (Рис. 3Б), по сравнению с контрольными, немаркированными клетками. Цифры и графики включают немаркированные клетки, в качестве контрольных.

3.4 Кинетика препарата в присутствии BioBran

Накопление DNR в MCF-7 клетках было изучено в присутствии или отсутствии BioBran в 15-ти минутные интервалы. На Рис. 4 показано, что была выявлена разница в накоплении DNR при 45 минутном воздействии с дальнейшим увеличением накопления при 60 минутах воздействия. Присутствие BioBran усилило накопление из данных средней флюоресценции по каналам измерения от 103 до 130.

4. Обсуждение

В данном исследовании мы изучили сенсибилизирующий эффект BioBran на клетки рака молочной железы человека к даунорубицину. Лечение с BioBran повысило восприимчивость MCF-7 и HCC70 клеток к DNR в 5.5 и 2.5 раз, соответственно, по сравнению с клетками, которые подверглись лечению только DNR. Более ранние исследования показали потенциальную возможность BioBran сокращать токсичные последствия химиотерапии у мышей и у пациентов, больных раком. Был отмечен положительный эффект BioBran на некоторые побочные явления противораковых препаратов, включая профилактику стремительной потери веса у мышей из-за цисплатина (CIS) и у крыс из-за CIS и адриамицина (ADR). Кроме того, результаты клинических исследований пациентов с прогрессирующим раком, которые подверглись химиотерапии в присутствии или отсутствии BioBran показали, что лечение с BioBran привело к более высокому уровню выживаемости и отмеченному улучшению аппетита у пациентов, получающих химиотерапию, по сравнению с пациентами, которые лечились только химиотерапией.

Рисунок 3. Эффект BioBran на накопление DNR в клетках рака молочной железы. MCF-7 и HCC70 клетки (1х10⁴) были инкубированы с DNR (2µм) в присутствии или без BioBran (500µг\мл) и накопление препарата оценивалось при помощи проточной цитометрии. (А) MCF-7 клетки. (В) HCC70 клетки

Предыдущие исследования показали, что другие пищевые добавки, такие как соевые изофлавоны и генистеин, повышают индукцию апоптоза опухолевых клеточных линий и замедляют рост опухоли у мышей, если применять добавки вместе с тамоксифеном. Кроме того, хлорелла (chlorella vulgaris) - одноклеточная пресноводная водоросль, принадлежащая к типу зеленых водорослей, смягчила некоторые побочные эффекты от 5-фторурацила в экспериментах с животными. А добавка витамина Е оказывает нейропротекторный эффект при химиотерапии.

В данной работе мы изучили механизм, при помощи которого BioBran повышает восприимчивость раковых клеток молочной железы к DNR. Наши результаты показывают, что BioBran повышает накопление DNR в MCF-7 и в HCC70 клетках. Несколько препаратов усиливают цитотоксический эффект химиотерапии в раковых клетках посредством повышения внутриклеточного накопления медицинского препарата, включая дилтиазем, блокатор кальциевых каналов, и изотиоцианат. Кроме того, недавно изучению подверглось нутритивное вмешательство относительно реакции опухоли на химиотерапию. Пардини (Pardini) заявил об усилении реакции опухоли на химиотерапию при приеме омега-3 полиненасыщенных жирных кислот, которые также увеличивают накопление препарата внутри клеток. Наконец, мы показали, что BioBran оказывает обратную резистентность в клетках линии HL60\ клетках, резистентных к адриамицину.

Исследования за последние два десятилетия обнаружили, что многие противораковые препараты индуцируют апоптоз. Недавно мы изучали роль BioBran в активации каспаза. Результаты показали, что лечение BioBran в результате привело к повышенному числу клеток рака, имеющих активированные каспазы 8 и 9 (MCF-7) и каспазы 3, 8 и 9 в клетках HCC70. Кроме того, сенсибилизирующий эффект к апоптозу лейкемических клеток человека HUT78 BioBran, был также связан с повышенным числом клеток с активными каспазами 3, 8 и 9. Это предполагает, что BioBran сенсибилизирует клетки рака к DNR посредством механизма, в который привлекает каскады каспаза. Аналогичные выводы недавно сделали Бодо и его коллеги (Bodo et al.). Накопление препаратов платины в клетках после периода лечения производными изотиоцианата, этил 4-изотиоцианатбутаноат, сопровождалось стимуляцией активности каспаза-3.

Перспективы противораковой активности BioBran привлекли внимание многих исследователей. BioBran представляет собой арабиноксилан, полученный из экстракта рисовых отрубей, который доказал свою эффективность, в качестве модификатора биологического ответа (МБО), который обладает способностью усиливать функции NK клеток, Т- и В-клеток, макрофагов и производство TNF-ɑ и IFN-γ (интерферон-гамма). Кроме того, BioBran показал некоторые дополнительные характеристики, как новый противоопухолевый препарат, способный сенсибилизировать: (1) лейкемические клетки человека к апоптозу индуцированному рецепторам (СD95); (2) дрожжи к апоптозу клеткок рака; (3) миелоидные лейкемические клетки к лечению ADR и (4) клетки рака молочный железы человека к лечению DNR, как показано в текущем исследовании. Другие продукты из рисовых отрубей также показали противораковую активность, включая полисахарид рисовых отрубе (RBS), фракцию липопротеина и агглютинина (RBA). Более того, последнее исследование показало, что рис (лат. Oryza sativa) замедляет рост лейкемических клеток человека U937 посредством активации мононуклеарных клеток периферийной крови. Мы пришли к выводу, что лечение клеток рака молочной железы человека при помощи BioBran значительно повышает восприимчивость клеток к химиопрепарату даунорубицин. Эти данные могут предположить, что BioBran в комплексе с химиотерапией может оказаться полезным дополнением при лечении рака молочной железы. 

Оригинальная версия статьи